Automatische genetische Analytik by Gunter Mertes, Thomas Schafer, Thomas A. Schild, Gerald

By Gunter Mertes, Thomas Schafer, Thomas A. Schild, Gerald Schmidt, Dagmar Schuster, Jorg vom Stein

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Die beiden Primer miissen so konstruiert werden, daB auch ihre Schmelztemperaturen T, ahnlich sind. Von der Vielzahl von Formeln zur Berechnung der T, lautet die einfachste T, = 2 (A+C) + 4 (G+C) -5 "C, wobei die Differenz von 5°C im Vergleich zur ursprunglichen Formel [6] nur einen Ausgangswert zur anschlieBenden experimentellen Optimierung der Annealing-Temperatur liefert. Kompliziertere Formeln [7, 81 beriicksichtigen auBerdem noch Salzkonzentrationen des Puffers sowie weitere thermodynamische Daten von Oligonukleotiden.

Der Strang von Interesse muB Biotin am 5'-Ende enthalten. Das 1aBt sich uber die Biotinylierung eines entsprechenden Primers erreichen. Die Biotinylierung ist durch das Anfugen (Addition) eines Biotinamidits im letzten Syntheseschritt an das 5'-Ende des Primers moglich. Zur Generierung von einzelstrangiger DNA wird rnit der Ziel-DNA eine symmctrische PCR durchgefuhrt. Als Ausgangsmaterial ist genomische DNA oder rekombinante DNA (Vektoren) geeignet. Einer der eingesetzten PCR-Primer liegt dabei am 5'-Ende rnit Biotin markiert vor.

Daruber hinaus ist sie zu einer Routinemethode in der medizinischen Diagnostik und der Forensik geworden und findet auch in anderen Disziplinen wie der Tier- oder Pflanzenzuchtung verbreitet Anwendung. 1 PCR - das Grundprinzip PCR ist eine Methode, die es ermoglicht, definierte Abschnitte auf der DNA mit einer hohen Spezifitat in vitro, also im ReaktionsgefaB, enzymatisch zu vervielfaltigen. Dies wird uber sich wiederholende, automatisierbare Zyklen erreicht, bei denen sich die Anzahl der DNA-Kopien mit jeder neuen Runde verdoppelt.

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